鳥槍克隆法

用于基因組或長DNA鏈的測序方法。又稱鳥槍法、鳥槍測序法、霰彈槍測序法。

先將整個(gè)基因組打亂成隨機(jī)碎片，然后將碎片克隆入載體，隨機(jī)挑選載體測定每個(gè)小片段序列，最終利用計(jì)算機(jī)對測序結(jié)果進(jìn)行排序和組裝，并確定整個(gè)基因組序列。由于這種測序方法中切割DNA為隨機(jī)片段類似于多彈頭的鳥槍（又名霰彈獵槍），因此以鳥槍法命名。

原理

誕生于20世紀(jì)70年代末，是在英國生物化學(xué)家F.桑格發(fā)明桑格-庫森法后，提出的又一革命性技術(shù)。桑格-庫森法只能用于100～1000個(gè)堿基對的短鏈DNA，對于較長的序列，需要被細(xì)分為可以單獨(dú)測序的較小片段，克隆入載體進(jìn)行測序，隨后將測序結(jié)果重新組裝以得到完整序列。長片段DNA測序的一種技術(shù)是染色體步移，將長的測序片段分割后，逐段依次測序，每測一段等于在染色體上移了一步，故稱之為染色體步移；另一種技術(shù)就是鳥槍克隆法，DNA被隨機(jī)分成許多小段，使用桑格-庫森法分別對其進(jìn)行測序，通過幾輪斷裂和測序獲得靶DNA的多重重疊測序結(jié)果，計(jì)算機(jī)程序利用不同測序片段的重疊末端將它們組裝成連續(xù)序列。鳥槍法速度快，簡單易行，成本較低，但海量測序數(shù)據(jù)的拼接和組裝需要大量的計(jì)算和合理的算法，是相對復(fù)雜的過程。所以鳥槍法最初多被用于小的微生物基因組的測序。

應(yīng)用

早期的鳥槍法測序需要首先建立基因組文庫，再選擇基因組文庫中的克隆，進(jìn)一步片段化、克隆入測序載體，形成亞克隆文庫，最終對亞克隆文庫進(jìn)行測序。1995年，美國基因組研究所（TIGR）完成了對流感嗜血桿菌的測序工作，第一次不再使用亞克隆文庫，而是直接切割基因組，使其成為非常小的片段（2千堿基對），產(chǎn)生隨機(jī)鳥槍文庫。另外，為了便于組裝和填補(bǔ)缺口，同時(shí)也構(gòu)建相對長的片段文庫（15～20千堿基對），對大量小片段文庫克隆和少量長片段文庫克隆進(jìn)行測序。改進(jìn)的鳥槍法需要更高數(shù)據(jù)量的測序，按照傳統(tǒng)方法測序流感嗜血桿菌，需構(gòu)建15個(gè)細(xì)菌人工染色體（BAC），每個(gè)片段長度為200千堿基對，需800個(gè)測序反應(yīng)，總共需要12000個(gè)測序反應(yīng)，而全基因組鳥槍法完成測序需要24000個(gè)反應(yīng)。隨后，利用這種改進(jìn)的鳥槍法，一些病毒的基因組陸續(xù)完成，如229千堿基對的巨細(xì)胞病毒基因組，186千堿基對的天花病毒基因組。樣品制備的自動化和測序技術(shù)的快速發(fā)展，使全基因組鳥槍法得以發(fā)展。

1990年人類基因組計(jì)劃正式啟動，英國、日本、法國、德國、中國和印度先后加入，形成了國際基因組測序聯(lián)盟。在國際計(jì)劃中，基因組被分割成多個(gè)片段（長度接近150千堿基對），構(gòu)建為BAC。對每一個(gè)片段進(jìn)行測序前，要先將其定位到每條染色體對應(yīng)位置，最終將這些片段通過配對末端法及其他許多定位數(shù)據(jù)重新組裝在一起，從而獲得完整的基因組，這被稱為“分級霰彈槍測序法”。1998年，美國生物學(xué)家J.C.文特爾[注]創(chuàng)辦了一家名為塞雷拉基因組的公司，開展獨(dú)立的人類基因組測序。與人類基因組計(jì)劃相比，他一改傳統(tǒng)的物理圖測序方法，采用全基因組鳥槍法測序，并且沒有使用附加的定位拼接，省卻了費(fèi)事費(fèi)力地制備物理圖的過程，因此大大加快了測序的時(shí)間周期，以更快的速度和更少的投資（3億美元，僅為人類基因組計(jì)劃的1/10）來完成此項(xiàng)工程。因?yàn)槿桌蚪M的競爭，促使人類基因組計(jì)劃不得不改進(jìn)其策略，進(jìn)一步加速其工作進(jìn)程，使得該計(jì)劃得以提前完成。

發(fā)展前景

經(jīng)典的鳥槍克隆法基于桑格-庫森法。現(xiàn)在的基因組測序項(xiàng)目通常由專業(yè)的測序公司來完成，新一代測序技術(shù)層出不窮，各有特點(diǎn)，測序成本不斷降低，在非常短的時(shí)間內(nèi)測序數(shù)據(jù)量達(dá)十萬或數(shù)百萬。但是這些技術(shù)中產(chǎn)生的每個(gè)反應(yīng)讀長較短（25～500堿基對），最長仍不超過900堿基對，所以鳥槍克隆法仍是通常的選擇方案。鳥槍克隆法與新一代測序技術(shù)及序列組裝軟件的結(jié)合，可以以更短的時(shí)間來完成整個(gè)基因組的測序，不斷刷新基因組測序速度和成本的紀(jì)錄。